Soutenance de thèse / PhD Defense - Geoffroy Gaschignard

Geoffroy Gaschignard, doctorant dans l'équipe BIOMIN de l'IMPMC soutient sa thèse lundi 25 septembre 2023 à 14 h.

IMPMC - Sorbonne Université - 4 place Jussieu - 75005 Paris - Barre 22-23, 4e étage, salle 401 

Etude structurale de la calcyanine, une nouvelle protéine impliquée dans la biominéralisation intracellulaire chez les cyanobactéries

Résumé

La biominéralisation est l'ensemble des processus qui aboutissent à la formation de minéraux par des êtres vivants. En 2012, un nouveau phénotype de biominéralisation a été décrit chez les cyanobactéries, caractérisé par la présence de précipités amorphes de carbonate d'alcalino-terreux au sein des cellules. Une analyse de génomique comparative a montré que ce phénotype de biominéralisation intracellulaire était associé à la présence d'un gène, encore non caractérisé, qui a été nommé ccyA, et qui code pour une protéine nommée calcyanine. La calcyanine a 4 variants qui partagent un même domaine C- terminal ((GlyZip)3), mais qui diffèrent au niveau de leur domaine N-terminal (CoBaHMA, X, Y ou Z). Aucun de ces 5 domaines n'est encore décrit dans la littérature.
L'objectif de cette thèse a été de caractériser la structure 3D de la calcyanine de Synechococcus calcipolaris, variant à domaine CoBaHMA, en combinant des approches bioinformatiques et expérimentales, afin de progresser dans la connaissance de sa fonction.
En combinant un ensemble de méthodes d’analyse de séquences et de modélisation de 3D structures, nous avons montré que le domaine CoBaHMA adopte un repliement « ferredoxin-like » typique de la superfamille HMA (« Heavy-Metal Associated ») et forme au sein de celle-ci une nouvelle famille, caractérisée par la conservation d’acides aminés basiques et la présence d’un brin β additionnel (1).
Nous avons ensuite réalisé des recherches avancées de similitudes de séquence, intégrant les informations dérivées des modèles de structure 3D. Nous avons ainsi montré que le domaine CoBaHMA est présent dans différentes organisations modulaires au sein de taxa variés. Il existe sous la forme de domaine unique, ou accompagné d’autres domaines, en particulier des systèmes
membranaires qui permettent, entre autre, le transport de substrats au travers des membranes (PIB-type ATPases, exporteurs ABC) ou qui constituent de nouvelles familles aux fonctions encore inconnues.
Ces résultats permettent de proposer des hypothèses quant à la fonction moléculaire du domaine CoBaHMA et aux processus cellulaires dans lesquels il est impliqué (2).
Nous avons également proposé un modèle cohérent des trois motifs glycine zippers individuels qui donnent leur nom au domaine (GlyZip)3 C-terminal des calcyanines. Ces glycine zippers forment une structure compacte de 2 hélices en épingle à cheveux, qui rappelle celle adoptée par des protéine transmembranaires formant des pores. Cependant, nous n’avons pu obtenir de modèle satisfaisant de l’assemblage des motifs glycine zipper (domaine (GlyZip)3), ni de leur interaction potentielle avec le
domaine CoBaHMA, renforçant ainsi l’intérêt d’une étude expérimentale.
Nous avons ainsi exprimé la calcyanine de S.calcipolaris chez Eschericha coli, et l’avons purifiée. Cependant cette protéine s'est avérée très peu stable, avec une propension à former un grand nombre d'objets de taille différentes en solution. Une expérience de protéolyse limitée a montré l'existence d'un fragment de la calcyanine résistant aux protéases, constitué du domaine CoBaHMA et du premier glycine zipper du domaine (GlyZip)3. Nous avons donc exprimé et purifié ce fragment fusionné à la
protéine MBP (« Maltose Binding Protein »), afin d’en augmenter la solubilité. Celui-ci ne forme qu'une espèce en solution, mais est très peu soluble après avoir été séparé de la MBP. Nous avons cependant réussi à obtenir des cristaux de ce fragment offrant des perspectives encourageantes pour résoudre sa structure expérimentale.
La calcyanine est donc une protéine difficile à étudier, tant par voie expérimentale que par modélisation. Néanmoins nous avons réussi à modéliser et caractériser plusieurs de ses fragments. Nous avons déduit de cette étude des informations pertinentes sur cette protéine, et plus particulièrement de son domaine CoBaHMA, dont la présence dans d’autres architectures protéiques ouvre des perspectives pour comprendre sa fonction et son évolution.
(1) Benzerara et al., 2022 14(3): evav026. doi :10.1093/gbe/evac026.
(2) Gaschignard et al., En préparation.

Structural study of calcyanin, a new protein involved in intracellular biomineralization in cyanobacteria

Abstract
Biomineralisation is all the processes that lead to the formation of minerals by living beings. In 2012, a new biomineralization phenotype has been described in cyanobacteria, characterized by the presence of amorphous alkaline-earth carbonate inclusions inside the cells. A comparative genomic analysis revealed that this intracellular biomineralisation phenotype is linked to the presence of one gene, unknown at the time, which has been called ccyA. It codes for one protein
called calcyanin. Calcyanin has 4 variants, that share the same C-terminus domain ((GlyZip)3), but which differ in their N-terminus domain (CoBaHMA, X, Y or Z). None of these 5 domains has already been described in the literature.
The goal of this PhD was to characterize the 3D structure of Synechococcus calcipolaris’s calcyanin, which has a CoBaHMA domain, by combining bioinformatics and experimental approaches, in order to make hypothesis regarding its role.
Through sequence analysis and 3D structure modeling, we showed that the CoBaHMA domain belongs to the “ferredoxin-like” fold, typical of the superfamily HMA (“Heavy Metal Associated”), and sets
itself as a new family in it, characterized by conserved basic amino acids and an additional β strand (1).
We have performed sequence similarity searches, refined with the structural information of the 3D structure models. This way, we showed that the CoBaHMA domain can be found on several different
protein architectures, in various taxa. It has an independent domain, or in conjunction with other domains, especially membrane systems which, among others, allow transports of substrates through the membrane (PIB-type ATPases, ABC exporters) or new families with unknown functions. These results lead us to formulate hypotheses regarding the CoBaHMA domain function (2).
We also proposed a robust model for the individual glycine zipper from which the name of the C- terminus domain (GlyZip)3 of calcyanins comes from. These glycine zippers have a structure ofa compact hairpin made of two helices, which is akin to the ones of transmembrane proteins that form pore. However, we were not able to model satisfyingly their assembly nor their possible interactions with the CoBaHMA domain, emphasizing the importance of studying the protein experimentally.
We successfully expressed calcyanin in Eschericha coli, and purified it. However the protein proved to be quite unstable, with a propensity to form a great diversity of objects with different sizes. A limited proteolysis experiment revealed the existence of a protease-resistant fragment of calcyanin, which encompasses the CoBaHMA domain and the first glycine zipper of the (GlyZip)3 domain. We expressed and purified this fragment, fused to MBP (« Maltose Binding Protein »). The fragment forms only one object in solution, but is prone to precipitation once separated from MBP. Yet we have
successfully obtained crystals of this fragment, which pave the way to solve its experimental 3D structure. Calcyanin is a difficult protein to work with, both experimentally and by bioinformatics. But we managed to model and characterize several of its fragments. From that, we inferred relevant information on calcyanin. More specifically, we highlighted a new family of domains, CoBaHMA, which presence on other protein architectures opens up new hints to understand its function and evolution.
(1) Benzerara et al., 2022 14(3): evav026. doi :10.1093/gbe/evac026.
(2) Gaschignard et al., En préparation.

Jury

• Frédéric MARIN – Directeur de recherche / Université de Bourgogne – Reviewer
• Guillaume LENOIR – Maître de conférences / Université Paris-Saclay – Reviewer
• Ingrid LAFONTAINE – Professeure / Sorbonne Université - Examiner
• Anne LOPES – Maîtresse de conférences / Université Paris-Saclay - Examiner
• Isabelle CALLEBAUT – Directrice de recherche / Sorbonne Université – Advisor
• Manuela DEZI – Maîtresse de conférences / Sorbonne Université – Co-Advisor
• Fériel SKOURI-PANET – Ingénieure de recherche / Sorbonne Université – Co-Advisor